Protocollo diagnostico per la caratterizzazione molecolare della Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD) attraverso multiplex PCR ed elettroforesi capillare

Le distrofie muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD) sono malattie degenerative della muscolatura scheletrica ad eredità recessiva legata al sesso. Il gene responsabile della patologia mappa sul braccio corto del cromosoma X, ed è organizzato in 79 esoni codificanti per una proteina strutturale del muscolo, la distrofina. La mutazione più frequente (65-70%) è la delezione intragenica di tratti più o meno estesi di DNA, mentre il rimanente 30-35% dei casi è dovuto a mutazioni diverse da delezioni.

La diagnosi  molecolare DMD/BMD viene oggi effettuata utilizzando metodiche complesse, di difficile interpretazione e poco automatizzate. Per far fronte a tale necessità abbiamo sviluppato DMD/BMD Detection kit (CE), che utilizza un protocollo diagnostico rapido ed efficace per l’identificazione di più del 95% delle delezioni nel gene della distrofina (65% circa dei casi di DMD/BMD). Il test consiste nella amplificazione simultanea di 18 esoni più il promotore del gene della distrofina con primers fluorescinati in 6’ FAM o in 5’ HEX (Chamberlain et al., 1988 e Beggs et al.,1990), con successiva separazione in elettroforesi capillare. Per la validazione del kit è stato condotto uno studio multicentrico. Sono stati reclutati 30 pazienti con diagnosi clinica e molecolare di DMD/BMD e 100 soggetti di controllo.

Il kit ha permesso di identificare tutti i pazienti con delezioni nei 19 esoni considerati (23 dei 30 pazienti). I restanti 7 pazienti non caratterizzati erano portatori di mutazioni non identificabili con il kit (duplicazioni, delezioni in esoni non considerati nel kit). Oltretutto, il kit non ha consentito di evidenziare delezioni in femmine portatrici, mostrando la sua accuratezza diagnostica solamente in soggetti di sesso maschile.

Lo studio multicentrico ha permesso di stabilire come la sensibilità e la specificità del test sia ? 99,9%, ed ha dimostrato che il kit, considerate attentamente le sue prestazioni ed i suoi limiti, è in grado di evidenziare il 95% delle delezioni osservate in pazienti DMD/BMD.

Pertanto, il kit può essere utilizzato, in sinergia con altre metodiche, per la diagnosi molecolare di DMD e BMD.